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基于朗繆爾張力儀研究抗菌肽與磷脂單層的相互作用
來源: 瀏覽 194 次 發布(bu)時間(jian):2024-05-30
研究(jiu)簡介:抗(kang)生(sheng)(sheng)素(su)(su)耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)(yao)(yao)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(AMR)已成為傳染病治療的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)最(zui)大障礙,對(dui)人(ren)類健康構成嚴重威脅(xie)。預計(ji)到2050年,全(quan)球將(jiang)有近1000萬(wan)人(ren)死于抗(kang)藥(yao)(yao)(yao)(yao)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)細(xi)(xi)(xi)菌(jun)(jun)(jun)(jun)感(gan)(gan)染,與AMR相(xiang)關的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)全(quan)球經(jing)濟損失(shi)將(jiang)達100萬(wan)億美元。因(yin)此開發(fa)能(neng)夠克服AMR的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)新型抗(kang)菌(jun)(jun)(jun)(jun)藥(yao)(yao)(yao)(yao)物至關重要(yao)。抗(kang)菌(jun)(jun)(jun)(jun)肽(tai)(tai)(tai)(AMP)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)出現為治療耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)(yao)(yao)菌(jun)(jun)(jun)(jun)提供(gong)了(le)(le)另一種方法。AMPs或宿(su)主(zhu)(zhu)防(fang)御肽(tai)(tai)(tai)(HDPs)具有強(qiang)效和(he)廣(guang)譜的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)抗(kang)菌(jun)(jun)(jun)(jun)活(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing),也適(shi)用于抗(kang)生(sheng)(sheng)素(su)(su)耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)(yao)(yao)細(xi)(xi)(xi)菌(jun)(jun)(jun)(jun)。與傳統(tong)抗(kang)生(sheng)(sheng)素(su)(su)不同,AMPs通(tong)(tong)(tong)過(guo)(guo)穿透和(he)破壞細(xi)(xi)(xi)菌(jun)(jun)(jun)(jun)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)膜(mo)發(fa)揮(hui)其(qi)(qi)抗(kang)菌(jun)(jun)(jun)(jun)作用,這(zhe)是一種進化的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)宿(su)主(zhu)(zhu)防(fang)御機制(zhi)。抗(kang)菌(jun)(jun)(jun)(jun)肽(tai)(tai)(tai)(AMP)或宿(su)主(zhu)(zhu)防(fang)御肽(tai)(tai)(tai)通(tong)(tong)(tong)過(guo)(guo)穿透和(he)破壞細(xi)(xi)(xi)菌(jun)(jun)(jun)(jun)膜(mo)起作用,因(yin)此與傳統(tong)抗(kang)生(sheng)(sheng)素(su)(su)相(xiang)比,不易產生(sheng)(sheng)抗(kang)菌(jun)(jun)(jun)(jun)素(su)(su)耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)(yao)(yao)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(AMR)。然(ran)而(er),天然(ran)存(cun)在(zai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)AMPs在(zai)臨床應用中仍(reng)然(ran)存(cun)在(zai)許多(duo)挑戰,需要(yao)進一步研究(jiu)以確定AMPs的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)化學(xue)結構與其(qi)(qi)抗(kang)菌(jun)(jun)(jun)(jun)活(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)和(he)選(xuan)擇性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)之(zhi)間的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)關系。研究(jiu)人(ren)員設計(ji)了(le)(le)一系列的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)AMP衍生(sheng)(sheng)自Ponericin-W1(一種來自螞蟻(yi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)天然(ran)AMP)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)化學(xue)結構與生(sheng)(sheng)物活(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)之(zhi)間關系的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)研究(jiu)。通(tong)(tong)(tong)過(guo)(guo)以系統(tong)方式修飾前導肽(tai)(tai)(tai)序列的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)疏水(shui)(shui)和(he)親(qin)水(shui)(shui)區域來設計(ji)抗(kang)菌(jun)(jun)(jun)(jun)肽(tai)(tai)(tai)。代表性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)肽(tai)(tai)(tai)At5的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)抗(kang)菌(jun)(jun)(jun)(jun)活(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)也在(zai)皮(pi)膚傷口感(gan)(gan)染的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)小鼠(shu)模型中進行(xing)了(le)(le)測(ce)試(shi)。研究(jiu)了(le)(le)肽(tai)(tai)(tai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)物理化學(xue)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)質與其(qi)(qi)抗(kang)菌(jun)(jun)(jun)(jun)活(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)之(zhi)間的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)關系。用疏水(shui)(shui)氨(an)基(ji)酸(suan)取代肽(tai)(tai)(tai)疏水(shui)(shui)區的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)陽離子氨(an)基(ji)酸(suan)增強(qiang)了(le)(le)它(ta)們的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)抗(kang)菌(jun)(jun)(jun)(jun)活(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing),增加親(qin)水(shui)(shui)區陽離子氨(an)基(ji)酸(suan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)數量(liang)降低了(le)(le)它(ta)們對(dui)人(ren)紅(hong)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)毒性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing),從而(er)提高了(le)(le)它(ta)們對(dui)細(xi)(xi)(xi)菌(jun)(jun)(jun)(jun)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)選(xuan)擇性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)。
Kibron朗繆爾張力儀的應用
使(shi)用(yong)(yong)4 mL內置(zhi)槽的(de)DeltaPi朗繆爾(er)張(zhang)力(li)儀(yi)(Kibron),研究(jiu)了肽(tai)與磷脂(zhi)(zhi)單層(ceng)的(de)相(xiang)互(hu)作用(yong)(yong)作為(wei)細菌(jun)和哺(bu)乳動(dong)物細胞膜的(de)體外模型。用(yong)(yong)4 mL去離(li)子水填充槽,并通(tong)(tong)過(guo)使(shi)用(yong)(yong)Hamilton微注射器將DPPC或DPPG在氯仿(0.2 mg mL-1)中的(de)溶(rong)液鋪展在水面形(xing)成脂(zhi)(zhi)質(zhi)單層(ceng)。氯仿蒸發后(hou),在空氣-水界面形(xing)成脂(zhi)(zhi)質(zhi)單分子層(ceng)。在最(zui)終濃度為(wei)10μM的(de)脂(zhi)(zhi)質(zhi)單層(ceng)下注射抗菌(jun)肽(tai)溶(rong)液后(hou),通(tong)(tong)過(guo)監測脂(zhi)(zhi)質(zhi)單層(ceng)表面壓力(li)的(de)變化(hua)(從28 mN m-1的(de)起始壓力(li))來研究(jiu)肽(tai)與脂(zhi)(zhi)質(zhi)單層(ceng)的(de)相(xiang)互(hu)作用(yong)(yong)。
實驗結果
研究了(le)(le)(le)基(ji)(ji)(ji)于源自天(tian)然螞蟻AMP Ponericin-W1的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)15個氨基(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)序(xu)列設(she)計(ji)(ji)了(le)(le)(le)11個新序(xu)列(At2-At12)。通(tong)過(guo)(guo)(guo)分(fen)子設(she)計(ji)(ji)和(he)抗(kang)菌(jun)實驗發現,用疏水(shui)殘(can)基(ji)(ji)(ji)取(qu)代(dai)疏水(shui)區(qu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)陽離子氨基(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)殘(can)基(ji)(ji)(ji)增(zeng)強了(le)(le)(le)多(duo)肽(tai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)疏水(shui)性(xing)(xing)和(he)抗(kang)菌(jun)作(zuo)用。增(zeng)加(jia)(jia)(jia)親水(shui)區(qu)陽離子氨基(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)殘(can)基(ji)(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)數(shu)(shu)量可降(jiang)低肽(tai)對人紅細(xi)胞的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)毒性(xing)(xing),并(bing)(bing)增(zeng)加(jia)(jia)(jia)肽(tai)對細(xi)菌(jun)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)選(xuan)(xuan)擇性(xing)(xing)。在這一系(xi)列肽(tai)中,At3、At5、At8和(he)At10對細(xi)菌(jun)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)選(xuan)(xuan)擇性(xing)(xing)高于哺乳動物宿主細(xi)胞,通(tong)過(guo)(guo)(guo)抗(kang)菌(jun)測定和(he)溶血(xue)活性(xing)(xing)測試顯示(shi)。設(she)計(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)肽(tai)對G?細(xi)菌(jun)多(duo)于G+細(xi)菌(jun)。掃描電(dian)鏡和(he)熒光(guang)顯微(wei)鏡顯示(shi)肽(tai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)殺菌(jun)作(zuo)用的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)主要機制是(shi)通(tong)過(guo)(guo)(guo)膜破壞。被認為是(shi)通(tong)過(guo)(guo)(guo)肽(tai)與細(xi)菌(jun)細(xi)胞膜中的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)脂質或LPS/LTA之間的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)靜電(dian)和(he)疏水(shui)相互作(zuo)用的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)組合來發揮(hui)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)。通(tong)過(guo)(guo)(guo)分(fen)子設(she)計(ji)(ji)和(he)抗(kang)菌(jun)實驗發現,用疏水(shui)殘(can)基(ji)(ji)(ji)取(qu)代(dai)疏水(shui)區(qu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)陽離子氨基(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)殘(can)基(ji)(ji)(ji)增(zeng)強了(le)(le)(le)多(duo)肽(tai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)疏水(shui)性(xing)(xing)和(he)抗(kang)菌(jun)作(zuo)用。增(zeng)加(jia)(jia)(jia)親水(shui)區(qu)陽離子氨基(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)殘(can)基(ji)(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)數(shu)(shu)量可降(jiang)低肽(tai)對人紅細(xi)胞的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)毒性(xing)(xing),并(bing)(bing)增(zeng)加(jia)(jia)(jia)肽(tai)對細(xi)菌(jun)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)選(xuan)(xuan)擇性(xing)(xing)。
圖1、用于確定(A)大腸桿(gan)菌和(he)(B)金黃色葡(pu)萄球(qiu)菌中肽的最(zui)低殺菌濃度(MBC)值的細菌培養物。
圖2、設計肽(tai)(tai)的(de)(de)(de)二級結構(gou)(gou)和(he)(he)(he)溶(rong)血(xue)(xue)特性(xing)。(A)水、(B)25 mM SDS、(C)兩性(xing)離子(zi)DPPC SUV(0.25 mg mL-1)和(he)(he)(he)(D)帶(dai)負電荷(he)的(de)(de)(de)DPPG SUV(0.25 mg mL-1)中(zhong)肽(tai)(tai)的(de)(de)(de)CD光(guang)(guang)譜。所有(you)四種肽(tai)(tai)(At3、At5、At8、At10)在水和(he)(he)(he)DPPC SUV中(zhong)均(jun)呈現無(wu)規卷曲結構(gou)(gou),而在SDS和(he)(he)(he)DPPG SUV中(zhong)均(jun)采用螺旋(xuan)(xuan)結構(gou)(gou)。肽(tai)(tai)濃(nong)(nong)度固定在0.1 mM。所有(you)測量均(jun)在室溫(wen)下(xia)進行。(E)DPPC和(he)(he)(he)DPPG SUV中(zhong)肽(tai)(tai)的(de)(de)(de)α-螺旋(xuan)(xuan)含量。(F)肽(tai)(tai)的(de)(de)(de)溶(rong)血(xue)(xue)活(huo)性(xing)。用不同濃(nong)(nong)度的(de)(de)(de)肽(tai)(tai)處理(li)人紅細(xi)胞(hRBC)并在37°C下(xia)孵育1小時。然后在OD540nm處測量吸光(guang)(guang)度。
圖3、設計的抗菌肽的疏水性由它們的HPLC保留時間(jian)確定,與(yu)它們對不同菌株(A)大腸桿(gan)菌、(B)銅綠假(jia)單胞(bao)菌、(C)金黃色葡萄球菌和(D)大腸桿(gan)菌的抗菌活(huo)性之(zhi)間(jian)的關系(xi)。
圖4、(A和(he)C)在(zai)亞相中注射抗菌肽后DPPC和(he)DPPG脂質(zhi)單(dan)層(ceng)的(de)表面(mian)(mian)壓(ya)力(li)變化。(B和(he)D)分別在(zai)注射抗菌肽(AMP)后DPPC和(he)DPPG脂質(zhi)單(dan)層(ceng)表面(mian)(mian)壓(ya)力(li)的(de)增(zeng)(zeng)加與DPPC和(he)DPPG中AMP的(de)螺旋度之(zhi)間的(de)相關性。注射抗菌肽后兩性離子DPPC脂質(zhi)單(dan)層(ceng)表面(mian)(mian)壓(ya)力(li)的(de)增(zeng)(zeng)加非常小,而(er)陰(yin)離子DPPG脂質(zhi)單(dan)層(ceng)表面(mian)(mian)壓(ya)力(li)的(de)增(zeng)(zeng)加相當高。
圖(tu)5、大(da)腸(chang)桿菌和金黃色葡萄球(qiu)菌在37°C下用(yong)不同濃(nong)度的(de)At5肽處理2小時前后的(de)活/死染色(×100放大(da)倍數(shu),比例尺(chi)=10μm)。
結論與展(zhan)望
本論(lun)文設(she)(she)計(ji)了(le)11種新(xin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)AMP(At2–At12,方案1)是(shi)使用(yong)從螞(ma)蟻中(zhong)發(fa)(fa)現的(de)(de)(de)(de)(de)(de)天(tian)然存(cun)在的(de)(de)(de)(de)(de)(de)AMP Ponericin-W1(At1)中(zhong)提(ti)取的(de)(de)(de)(de)(de)(de)15個氨基酸(suan)序列作為(wei)(wei)設(she)(she)計(ji)模板進行設(she)(she)計(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)。系統(tong)研究了(le)氨基酸(suan)類型、疏水性(xing)(xing)(xing)(xing)和(he)親水性(xing)(xing)(xing)(xing)氨基酸(suan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)比(bi)例(li)和(he)位置、肽電荷(he)密(mi)度(du)和(he)二級結構對(dui)AMPs對(dui)革蘭(lan)氏陽性(xing)(xing)(xing)(xing)菌(jun)(jun)和(he)革蘭(lan)氏陰性(xing)(xing)(xing)(xing)菌(jun)(jun)抗(kang)(kang)菌(jun)(jun)性(xing)(xing)(xing)(xing)能的(de)(de)(de)(de)(de)(de)影(ying)響。測(ce)定了(le)肽的(de)(de)(de)(de)(de)(de)物理化學性(xing)(xing)(xing)(xing)質,例(li)如疏水性(xing)(xing)(xing)(xing)和(he)表面活(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing),并(bing)評估(gu)了(le)它(ta)們的(de)(de)(de)(de)(de)(de)溶血活(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)和(he)AMR對(dui)設(she)(she)計(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)AMP的(de)(de)(de)(de)(de)(de)發(fa)(fa)展。所提(ti)出的(de)(de)(de)(de)(de)(de)基于天(tian)然抗(kang)(kang)菌(jun)(jun)肽的(de)(de)(de)(de)(de)(de)分子設(she)(she)計(ji)策略可以(yi)為(wei)(wei)開發(fa)(fa)具(ju)有增強(qiang)抗(kang)(kang)菌(jun)(jun)活(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)和(he)減(jian)少AMR機會(hui)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)新(xin)AMP提(ti)供強(qiang)大的(de)(de)(de)(de)(de)(de)工具(ju)。本研究的(de)(de)(de)(de)(de)(de)結果可以(yi)更好地理解AMP的(de)(de)(de)(de)(de)(de)選擇性(xing)(xing)(xing)(xing)抗(kang)(kang)菌(jun)(jun)活(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)所需的(de)(de)(de)(de)(de)(de)結構特征,并(bing)可作為(wei)(wei)開發(fa)(fa)具(ju)有增強(qiang)生物學特性(xing)(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)新(xin)AMP的(de)(de)(de)(de)(de)(de)指南(nan)。未(wei)來的(de)(de)(de)(de)(de)(de)研究將針對(dui)結構修飾,以(yi)賦予肽更高(gao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)抗(kang)(kang)G+細菌(jun)(jun)抗(kang)(kang)菌(jun)(jun)活(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing),從而拓(tuo)寬這些肽的(de)(de)(de)(de)(de)(de)抗(kang)(kang)菌(jun)(jun)活(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)譜。
芬(fen)蘭Kibron朗繆爾張(zhang)力儀(yi)可監(jian)測單(dan)(dan)(dan)分子(zi)層上的(de)(de)(de)酶的(de)(de)(de)作用;蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)的(de)(de)(de)二維結晶;測量(liang)藥物、肽/蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)與磷脂(zhi)(zhi)(zhi)單(dan)(dan)(dan)分子(zi)層的(de)(de)(de)特殊相互(hu)作用;核(he)酸(DNA、siRNA)和陽離子(zi)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)體的(de)(de)(de)絡合物生成。用于檢測藥物、肽/蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)和核(he)酸對(dui)于特定磷脂(zhi)(zhi)(zhi)構成單(dan)(dan)(dan)分子(zi)層的(de)(de)(de)結合和穿透,精確控(kong)制(zhi)磷脂(zhi)(zhi)(zhi)單(dan)(dan)(dan)分子(zi)膜的(de)(de)(de)橫向堆積(ji)密度。磁(ci)力攪拌(ban)樣(yang)品(pin)的(de)(de)(de)體積(ji)最(zui)低為150微(wei)升,可確保(bao)材料消耗(hao)非(fei)常低。例(li)如(ru),1毫克抗菌(jun)肽足以全面描述其脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)結合特性。而且,材料的(de)(de)(de)選(xuan)擇排除(chu)了多余的(de)(de)(de)非(fei)特異性表面效(xiao)應。