摘要

底物(wu)特異性(xing)是(shi)表征酶的(de)(de)(de)(de)一個關鍵參數，它(ta)直(zhi)接(jie)關系到酶的(de)(de)(de)(de)應用(yong)潛力。商(shang)品化的(de)(de)(de)(de)Lecitase Ultra已(yi)被廣泛用(yong)于石(shi)油(you)脫膠(jiao)過程中，以特異性(xing)水(shui)解(jie)(jie)原(yuan)油(you)中的(de)(de)(de)(de)磷(lin)(lin)(lin)脂，但(dan)其對各種(zhong)(zhong)磷(lin)(lin)(lin)脂的(de)(de)(de)(de)特異性(xing)仍不清楚(chu)。在(zai)(zai)本研(yan)究中，采(cai)用(yong)單(dan)(dan)層技術，在(zai)(zai)不同(tong)的(de)(de)(de)(de)表面壓力條件下表征了超(chao)乳糖(tang)酸酶對不同(tong)種(zhong)(zhong)類磷(lin)(lin)(lin)脂的(de)(de)(de)(de)選(xuan)擇性(xing)。超(chao)乳糖(tang)酸酶對各種(zhong)(zhong)磷(lin)(lin)(lin)脂的(de)(de)(de)(de)水(shui)解(jie)(jie)活(huo)(huo)性(xing)高度依賴于單(dan)(dan)層膜(mo)的(de)(de)(de)(de)表面壓力。在(zai)(zai)相(xiang)同(tong)的(de)(de)(de)(de)表面壓力（25mN/m）下，在(zai)(zai)所有(you)磷(lin)(lin)(lin)脂單(dan)(dan)層膜(mo)的(de)(de)(de)(de)液體冷凝狀態下，超(chao)卵磷(lin)(lin)(lin)脂酶對不同(tong)單(dan)(dan)分子磷(lin)(lin)(lin)脂膜(mo)的(de)(de)(de)(de)偏好順(shun)序為(wei)PE>CL>PS>PI>PC。在(zai)(zai)測(ce)試(shi)的(de)(de)(de)(de)表面壓力范圍內，未觀察到鞘磷(lin)(lin)(lin)脂的(de)(de)(de)(de)水(shui)解(jie)(jie)活(huo)(huo)性(xing)。目(mu)前(qian)的(de)(de)(de)(de)研(yan)究提供(gong)了關于Lecitase Ultra對各種(zhong)(zhong)磷(lin)(lin)(lin)脂的(de)(de)(de)(de)選(xuan)擇性(xing)偏好順(shun)序的(de)(de)(de)(de)基(ji)本信(xin)息，這是(shi)以前(qian)未知的(de)(de)(de)(de)，并為(wei)更好地利用(yong)這種(zhong)(zhong)酶在(zai)(zai)石(shi)油(you)工業(ye)中提供(gong)了額外的(de)(de)(de)(de)信(xin)息。

實際應用

據我們(men)(men)所知，我們(men)(men)已經報道了應(ying)用單層技(ji)術(shu)研(yan)究(jiu)超(chao)乳糖酸酶(mei)對各種(zhong)天(tian)然磷脂(zhi)的(de)底(di)(di)物選擇性。這項研(yan)究(jiu)直接(jie)有助于該酶(mei)在工(gong)(gong)業中的(de)應(ying)用。此外(wai)，我們(men)(men)試圖證明單層技(ji)術(shu)對于評估某(mou)些(xie)天(tian)然底(di)(di)物的(de)酶(mei)活性是非常有效和簡單的(de)，并且(qie)應(ying)該在界面酶(mei)工(gong)(gong)程領域做出更大的(de)貢獻(xian)。

圖形摘要

利用單層(ceng)技術表征超乳糖(tang)酸酶對不(bu)同磷脂的界面催化(hua)性能。

1、介紹

Lecitase Ultra是藍綠假單胞菌脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)肪(fang)酶(mei)（TLL）和尖孢鐮刀菌脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)肪(fang)酶(mei)（FOL）的(de)(de)(de)(de)嵌(qian)合體[1]，具有相當高的(de)(de)(de)(de)磷(lin)(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酶(mei)活性和脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)肪(fang)酶(mei)活性[2]。這種酶(mei)完全基于其(qi)磷(lin)(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酶(mei)活性，能夠水解油中(zhong)的(de)(de)(de)(de)磷(lin)(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)，并通(tong)過形成(cheng)(cheng)溶血磷(lin)(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)和甘油磷(lin)(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)將其(qi)去除，從而(er)成(cheng)(cheng)功地用于植(zhi)物油的(de)(de)(de)(de)脫膠(jiao)[3,4]。正如(ru)我們所知，不同來源的(de)(de)(de)(de)原油中(zhong)磷(lin)(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)組成(cheng)(cheng)和含量(liang)存在顯著差異(yi)：例如(ru)，原油中(zhong)的(de)(de)(de)(de)卵(luan)磷(lin)(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)通(tong)常含有20%的(de)(de)(de)(de)磷(lin)(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酰膽堿（PC）、15%的(de)(de)(de)(de)磷(lin)(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酰乙醇胺(an)（PE）、20%的(de)(de)(de)(de)磷(lin)(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酰肌醇（PI）、5%的(de)(de)(de)(de)磷(lin)(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酸（PA）和其(qi)他磷(lin)(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)[5]。因此，Lecitase Ultra對不同磷(lin)(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)選擇(ze)性是實際(ji)應(ying)用中(zhong)的(de)(de)(de)(de)一個重(zhong)要參考指標(biao)，這反(fan)過來又與應(ying)添加的(de)(de)(de)(de)酶(mei)量(liang)以(yi)及(ji)脫膠(jiao)過程中(zhong)所需的(de)(de)(de)(de)反(fan)應(ying)時間直接相關。因此，獲得這種酶(mei)對天(tian)然磷(lin)(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)選擇(ze)性信息尤(you)為重(zhong)要。然而(er)，仍然缺乏(fa)對這方面(mian)的(de)(de)(de)(de)深入了解。

脂(zhi)肪酶作(zuo)為一種(zhong)界(jie)(jie)面酶，催(cui)化不溶性底物與(yu)水之(zhi)間的(de)界(jie)(jie)面水解反應(ying)[6]。因此，脂(zhi)肪分解的(de)催(cui)化反應(ying)與(yu)各種(zhong)界(jie)(jie)面現象有關，并強(qiang)烈(lie)依(yi)賴(lai)于界(jie)(jie)面上(shang)存在的(de)脂(zhi)質基(ji)質的(de)結構組織[6-8]。為了(le)獲得有關酶對各種(zhong)磷脂(zhi)選擇性的(de)適當信息，選擇合適的(de)測試(shi)方(fang)法至關重要，應(ying)該是首(shou)要考慮的(de)問題。

單(dan)層技(ji)術(shu)是(shi)研(yan)究空(kong)氣/水界(jie)面(mian)上酶(mei)(mei)(mei)(mei)-脂(zhi)質相互作用(yong)(yong)(yong)的最通(tong)用(yong)(yong)(yong)的實(shi)驗系統(tong)，已(yi)被用(yong)(yong)(yong)于通(tong)過(guo)相對表(biao)面(mian)活性(xing)來比(bi)較脂(zhi)肪酶(mei)(mei)(mei)(mei)的底(di)物(wu)(wu)(wu)選擇性(xing)[9]。使用(yong)(yong)(yong)單(dan)層技(ji)術(shu)進行(xing)酶(mei)(mei)(mei)(mei)表(biao)征有幾個優(you)點。首先(xian)，底(di)物(wu)(wu)(wu)和(he)酶(mei)(mei)(mei)(mei)只(zhi)需要(yao)少量的物(wu)(wu)(wu)質。因此，我們可(ke)以(yi)(yi)以(yi)(yi)非常低的成本(ben)獲得酶(mei)(mei)(mei)(mei)的活性(xing)信息(xi)。其次，可(ke)以(yi)(yi)改變表(biao)面(mian)組分(fen)(fen)的分(fen)(fen)子堆積，并且可(ke)以(yi)(yi)連續監測脂(zhi)質或蛋白質從界(jie)面(mian)的釋放或轉移到(dao)界(jie)面(mian)的情況(kuang)。第三，與傳統(tong)的pH-stat方法(fa)相比(bi)，該方法(fa)的高靈(ling)敏度(du)已(yi)通(tong)過(guo)實(shi)驗得到(dao)驗證[10,11]。最后，反應的物(wu)(wu)(wu)理化學參(can)數，如溫度(du)、側壓(ya)、分(fen)(fen)子密(mi)度(du)、離子條件(jian)等，可(ke)以(yi)(yi)在(zai)很寬(kuan)的范(fan)圍內方便(bian)地改變，并且可(ke)以(yi)(yi)以(yi)(yi)?精度(du)分(fen)(fen)析(xi)結構[12]。因此，單(dan)分(fen)(fen)子層是(shi)研(yan)究界(jie)面(mian)酶(mei)(mei)(mei)(mei)反應的合適模型。到(dao)目前為止(zhi)，不同(tong)種類(lei)的脂(zhi)肪酶(mei)(mei)(mei)(mei)，甚至磷(lin)脂(zhi)酶(mei)(mei)(mei)(mei)（包括磷(lin)脂(zhi)酶(mei)(mei)(mei)(mei)A2、C和(he)D）已(yi)經通(tong)過(guo)使用(yong)(yong)(yong)這(zhe)種方法(fa)進行(xing)了表(biao)征[11-14]。

本(ben)文(wen)首次采用單層技(ji)術對商(shang)品(pin)化超乳糖酸酶(mei)的(de)(de)底物選(xuan)擇性(xing)進行了表征。目前的(de)(de)結(jie)果不(bu)僅提供了對酶(mei)底物選(xuan)擇性(xing)的(de)(de)透(tou)徹理解，而且(qie)為(wei)酶(mei)在石油工(gong)業中(zhong)的(de)(de)具(ju)體用途(tu)提供了詳細信息。

2、材料和方法

2.1材料

商業Lecitase Ultra由丹麥巴格斯瓦(wa)爾德(de)諾維信A/S提供，直接測試，無需(xu)進(jin)一步純化。L-α-磷(lin)(lin)脂(zhi)酰肌(ji)醇（PI，純度≥1,2-二(er)酰基-sn-甘(gan)油-3-磷(lin)(lin)酸-L-絲氨酸（PS，純度≥97%），L-α-磷(lin)(lin)脂(zhi)酰乙醇胺（PE，純度≥1,2-二(er)油基-sn-甘(gan)油-3-磷(lin)(lin)酸膽堿(jian)（PC，純度≥97%），心磷(lin)(lin)脂(zhi)（CL，純度）≥鞘磷(lin)(lin)脂(zhi)（SM，純度）≥98%）和β-環(huan)糊精從Sigma-Aldrich（密(mi)蘇(su)里州(zhou)圣路易斯）購(gou)買。HPLC級氯仿(fang)購(gou)自凱美爾化學試劑有限公司(si)（天津）。使用Millipore（馬薩(sa)諸塞州(zhou)貝德(de)福德(de)）Milli-Q水系統凈化水。所有其他攝政王都是分析(xi)級的(de)。

2.2單分子薄膜實驗

2.2.1表面壓力-面積等溫線

使(shi)用(yong)帶(dai)有Langmuir-Teflon槽（206 mm×59 mm）的(de)(de)(de)(de)商用(yong)單層(ceng)系統（芬蘭(lan)赫爾辛基(ji)Kibron的(de)(de)(de)(de)微槽X）和(he)兩(liang)個屏障的(de)(de)(de)(de)對稱壓縮(suo)，記(ji)錄不同(tong)磷(lin)脂單層(ceng)的(de)(de)(de)(de)壓縮(suo)等(deng)溫(wen)線(xian)(xian)。實驗在(zai)室溫(wen)（25℃）下進行。通過使(shi)用(yong)microsyringe（Hamilton Co.，Reno，NV）將不同(tong)磷(lin)脂的(de)(de)(de)(de)氯仿儲(chu)備溶液(ye)滴在(zai)50 mM檸檬酸緩沖液(ye)（pH 5.0）亞相上形成單層(ceng)（Hamilton Co.，Reno，NV）。15分鐘后，以(yi)2.5 mm/min的(de)(de)(de)(de)速率(lv)連續(xu)壓縮(suo)所需(xu)組合物的(de)(de)(de)(de)單層(ceng)。表面壓力(li)是用(yong)附著在(zai)表面的(de)(de)(de)(de)金屬絲探針測(ce)量(liang)的(de)(de)(de)(de)。連續(xu)記(ji)錄表面壓力(li)與表面積（π-A）等(deng)溫(wen)線(xian)(xian)。只要需(xu)要，膠片就(jiu)被(bei)壓縮(suo)到崩潰壓力(li)。每(mei)次運行重復三次，保持π-A等(deng)溫(wen)線(xian)(xian)的(de)(de)(de)(de)標準偏差小于4?2。

2.2.2使用一個(ge)"零級"槽（由一個(ge)圓形(xing)反應室(shi)(shi)和兩個(ge)儲(chu)液室(shi)(shi)（182mm×40mm）組成）進(jin)(jin)行了Lecitase Ultra的(de)(de)動力(li)學水(shui)解活性(xing)計算。反應室(shi)(shi)的(de)(de)直(zhi)徑為(wei)(wei)21 mm，面(mian)積為(wei)(wei)346 mm2。這(zhe)兩種隔室(shi)(shi)通(tong)(tong)過一個(ge)小(xiao)的(de)(de)表(biao)面(mian)通(tong)(tong)道（寬0.5厘米）相(xiang)互(hu)連接。該(gai)方法(fa)的(de)(de)原理之前由Verger和De Haas[15]描述。在目前的(de)(de)工作中，用毫(hao)Q水(shui)制(zhi)備(bei)50 mM檸檬酸緩沖(chong)液（pH 5.0），并(bing)通(tong)(tong)過0.45μm微(wei)孔膜(mo)過濾。在50 mM檸檬酸緩沖(chong)液（pH 5.0）亞相(xiang)上涂抹幾微(wei)升氯仿磷(lin)脂(zhi)溶(rong)液，直(zhi)到達到所(suo)需的(de)(de)初(chu)始表(biao)面(mian)壓(ya)(ya)力(li)（πi），制(zhi)備(bei)單層(ceng)。由恒壓(ya)(ya)器自動驅動的(de)(de)移(yi)動式(shi)屏障在儲(chu)層(ceng)上來回移(yi)動，以(yi)(yi)壓(ya)(ya)縮并(bing)保持表(biao)面(mian)壓(ya)(ya)力(li)（π）恒定(ding)。為(wei)(wei)了確保水(shui)解反應中產生(sheng)的(de)(de)長鏈脂(zhi)肪酸能(neng)夠(gou)溶(rong)解在水(shui)中，按照Mosbah等人的(de)(de)建議，將β-環糊(hu)精(jing)（0.6 mg/ml）注入反應室(shi)(shi)。[10]。然后將10μL酶溶(rong)液注入反應室(shi)(shi)的(de)(de)亞相(xiang)以(yi)(yi)開始反應。如前所(suo)述，對數據進(jin)(jin)行了相(xiang)應的(de)(de)分析[15,16]。活性(xing)顯示為(wei)(wei)單位時間、單位反應室(shi)(shi)面(mian)積和"零級"槽中每毫(hao)升酶水(shui)解的(de)(de)底物(wu)摩爾(er)數（摩爾(er)數cm-2.min-1.mL-1）。所(suo)有(you)分析測定(ding)均(jun)一式(shi)三份進(jin)(jin)行。結果以(yi)(yi)平均(jun)標準偏(pian)差（SD）的(de)(de)形(xing)式(shi)清楚地呈現。